使用奧林巴斯正置熒光顯微鏡 CX33 觀察植物細胞時，需結合植物細胞的結構特點（如細胞壁、葉綠體等）和熒光標記需求，從樣品制備到顯微鏡操作進行系統性規劃。以下是詳細步驟及注意事項：

一、樣品制備與熒光標記

1. 植物材料選擇與預處理

材料類型：

幼嫩葉片（如擬南芥、煙草）、根尖、花粉管等薄而透明的組織，可直接撕取表皮或制作徒手切片；

較厚的組織（如莖稈、成熟葉片）需用切片機切成 50-100 μm 的薄片，或通過壓片法（如根尖染色體觀察）分散細胞。

預處理（可選）：

固定：若觀察動態結構（如微管、細胞器運動），可用 4% 多聚甲醛固定 15-30 分鐘，避免細胞結構破壞；

通透：需標記胞內蛋白時，用 0.1% Triton X-100 處理 5-10 分鐘，增強染料進入細胞的效率。

2. 熒光染色與標記

根據觀察目標選擇染料：

觀察對象常用熒光染料 / 標記方法激發 / 發射波長（參考）操作要點

細胞核 / DNADAPI（藍色熒光）、Hoechst激發 358nm / 發射 461nm染色 5-10 分鐘，需避光；可與 RNA 酶預處理減少非特異性結合。

細胞壁Calcofluor White（白色熒光）激發 350nm / 發射 440nm直接滴加染液染色 2-5 分鐘，適用于纖維素和幾丁質檢測。

葉綠體自發熒光（紅色）激發 430-480nm / 發射 650-700nm無需染色，直接觀察；避免強光長時間照射導致熒光淬滅。

特定蛋白GFP/GFP 融合蛋白（綠色熒光）激發 488nm / 發射 507nm通過轉基因或病毒載體導入植物細胞，需培養 24-48 小時后觀察。

線粒體Mito-Tracker Red（紅色熒光）激發 579nm / 發射 599nm工作濃度 100nM，37℃染色 15-20 分鐘，需避光。

制片注意事項：

將染色后的樣品置于載玻片中央，滴加少量蒸餾水或 PBS 緩沖液（避免細胞脫水），蓋上蓋玻片時從一側緩慢放下，避免氣泡產生；

若樣品易移動，可在蓋玻片四周用凡士林或指甲油封片，增強穩定性。

二、顯微鏡操作流程

1. 基礎光路調節

放置與開機：將顯微鏡放置于穩定臺面，遠離光源直射和振動源，開啟電源，預熱光源（汞燈或 LED 光源需預熱 5-10 分鐘至亮度穩定）。

低倍鏡找樣：

安裝 10× 低倍物鏡，將樣品裝片置于載物臺，用壓片夾固定，使樣品正對通光孔；

調節粗準焦螺旋下降鏡筒（目視側面避免物鏡壓片），再緩慢上升鏡筒，直至視野中出現清晰的細胞輪廓（可通過調節聚光器高度和孔徑光闌改善對比度，植物細胞因有細胞壁，可適當縮小光闌增強結構反差）。

2. 熒光觀察參數設置

選擇濾光片組：

根據熒光染料波長選擇對應濾光片，例如：

DAPI/Calcofluor White：使用 UV（激發 330-385nm，發射 420nm 以上）濾光片組；

GFP：使用 BP470/40（激發 470nm）+ DM495（分束鏡）+ BP525/50（發射 525nm）濾光片組；

葉綠體自發熒光 / Red 熒光染料：使用 BP545/30（激發 545nm）+ DM575 + BP605/70 濾光片組。

調節熒光強度：

初始觀察時將光源強度調至 50%，避免強光損傷樣品或產生背景噪聲；

通過調節熒光光路中的光闌或中性密度濾鏡（ND 濾鏡）控制光強，兼顧信號亮度和抗淬滅性。

3. 高倍鏡精細觀察與對焦

切換物鏡：在低倍鏡下將目標細胞移至視野中央，轉動物鏡轉換器至 40× 或 60× 高倍物鏡（若觀察亞細胞結構，可使用 100× 油鏡，需在蓋玻片上滴加一滴香柏油，使物鏡與樣品光學接觸）；

微調焦與景深控制：

使用細準焦螺旋緩慢調節焦距，植物細胞因有大液泡，可能需要分層對焦（如聚焦于細胞核、葉綠體層）；

若細胞厚度較大導致熒光信號重疊，可通過顯微鏡配套的 Z 軸掃描功能（如有）進行多層拍攝，后期用軟件疊加或三維重建。

三、關鍵注意事項

1. 樣品與染色優化

自發熒光干擾：植物細胞中的葉綠素（紅色熒光）、木質素（藍色熒光）可能對觀察產生背景干擾，可通過以下方式減少：

選擇不含葉綠體的組織（如根尖、莖尖分生區）；

使用窄帶濾光片或調節激發光波長，避開自發熒光峰值；

拍攝時降低熒光通道的增益或曝光時間。

染色特異性：

熒光染料需現配現用，DAPI、Calcofluor White 等需避光保存；

染色后用緩沖液充分洗滌，去除未結合的染料，減少背景熒光。

2. 顯微鏡操作技巧

避免光損傷：熒光觀察時避免長時間照射樣品（尤其是 GFP 等易淬滅的標記），可通過 “快速預覽 - 定位 - 短時間拍攝" 的方式操作；

色差校正：高倍鏡觀察時，若出現彩色邊緣，可通過調節物鏡上的色差補償環（若有）或使用復消色差物鏡改善。

3. LV2000顯微鏡相機圖像采集與分析

參數設置：成像軟件中調整曝光時間（通常 50-500ms，根據熒光強度）、增益（避免過高導致噪點），勾選 “線性響應" 模式保證信號真實性；

多通道拍攝：若同時觀察多種熒光（如 DAPI+GFP），需采用順序掃描模式（避免通道串色），并保存為多通道 TIFF 格式以便后期分析。

四、常見問題與解決方案

問題可能原因解決方案

熒光信號弱染色濃度不足、激發光強度低增加染料濃度、延長染色時間；調大光源強度或更換新燈泡（汞燈壽命約 200 小時）

背景熒光強染料未洗凈、自發熒光干擾增加洗滌次數；選擇無自發熒光的組織或使用淬滅劑（如 DABCO）

圖像模糊對焦不準、樣品移動重新微調焦；用指甲油封片固定樣品；檢查載物臺是否穩固

葉綠體自發熒光干擾激發光波長與葉綠素重疊更換長波激發濾光片（如觀察 GFP 時用 488nm 激發，避開葉綠素 430nm 激發峰值）

通過以上步驟，可高效利用奧林巴斯 CX33 正置熒光顯微鏡觀察植物細胞的亞細胞結構、蛋白定位或生理過程，結合熒光標記技術實現對植物細胞動態行為的精準分析。